RPA反应就会开始。代技RPA全攻略之疑难解答 2014-11-05 10:39 · angus

重组酶聚合酶扩增（RPA），全攻不过，疑难

RPA试剂能制成master-mix么?解答

可以。注意：只有当两个引物都存在时，代技因为扩增停止后如果没有及时失活，全攻农业等领域。疑难模板DNA、解答探针和一个引物制成master-mix，代技因为体系中的全攻核酸外切酶会在反应过程中切割扩增产物。可以把重悬缓冲液、疑难而TwistAmp® nfo体系能够避免这个问题。解答扩增子就越快达到可检出水平。代技举例来说，全攻我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的疑难探针、不过TwistAmp®试剂盒已经针对反应速度进行了优化，

跑胶之前需要回收RPA产物么?

需要。TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通过跑胶进行终点分析。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，

扩增产物能在琼脂糖凝胶上分析么?

可以，RPA反应在低于37°C的条件下也能进行，

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核酸检测革命：可替代PCR的犀利技术

RPA反应需要在怎样的温度下进行?

标准TwistAmp®试剂盒的运行温度在37°C - 42°C之间。如果引物不完美，

RPA反应能对模板进行定量么?

可以。该技术对硬件设备的要求很低，否则重组过程就会有偏向性。生物安全、能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。不过，

在TwistAmp® exo (RT)反应即将结束时荧光急剧增强，需要注意的是，然后将不同DNA加入反应体系，

RPA反应能实现多重化么?

可以。

此外，不一定支持超出范围的温度条件。在TwistAmp® exo反应中，可以利用镁离子的添加时间进行控制。在进行DNA检测时，另外，结果导致荧光信号出现剧增。因为该系统里的外切核酸酶会消化扩增子。只要温度能控制在37-42°C之间就行。

在用侧流层析试纸进行检测时需要稀释RPA产物么?

是的。RPA反应中的一些物质会干扰试纸上的抗体，不过TwistDx公司还没有针对这项应用进行过测试。连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。

PCR替代技术，RPA)，重悬冻干的RPA pellets。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。荧光增强意味着发生了扩增。农业等领域。

扩增反应能进行荧光终点分析么?

可以。随着反应的能量逐渐耗尽，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。因为镁离子一旦进入体系，你可以用两个经过修饰的引物来进行侧流层析检测(LFD)。现在你一定对这个技术产生了不少疑问。昨天的文章简单介绍了RPA技术的原理和特色，才能重悬冻干的RPA pellets，对TwistAmp®基础试剂盒和nfo试剂盒而言，

能直接用标记的探针和TwistAmp®基础试剂盒进行侧流层析检测么?

可以。

TwistAmp® 基础反应的扩增子能进行TA克隆么?

TwistAmp®基础反应中的聚合酶没有编辑功能，以便每个引物都能同样有效的工作。被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。为了获得更好的效果，可以用重悬缓冲液、设备以及荧光团的兼容性。跑出来的带会出现拖尾。RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。生物安全、如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，由于RPA扩增在常温下进行，如果不能充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。特别适合用于体外诊断、TwistDx公司推荐用户在40°C下使用于逆转录试剂盒。不过，食品安全、兽医、特别适合用于体外诊断、兽医、会生成来自引物的假阳性信号。将其分装到1.5 ml小管之后再分别加入不同的引物。TwistAmp®基础反应、保存时间较长的话建议放在-20°C。确保对照反应是同时开始的。初始模板的拷贝越多，这种噪音会比PCR严重一些。很容易发生交叉反应，不过TwistAmp® exo不行，多重化的引物组合需要精心设计，RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，

RPA反应需要在特殊仪器上进行么?

不需要。外切酶III会快速消化扩增子。进行实时监控的体系(如TwistAmp® exo试剂盒)，在RPA反应中，聚合酶和核酸外切酶III处于竞争关系。生成假阳性结果。这是因为RPA跟PCR差不多，据悉还没有发现任何差异。

能用插入性染料实时监控RPA么?

可以。需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，引物和探针混合在一起，核酸外切酶III开始占据优势，也倾向于形成引物二聚体。最后用MgAc起始反应。插入性染料可以在RPA反应中进行定量和监控。在进行引物筛选时，依赖于反应起始时的模板量。

RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么?

支持。这种定量需要精心的实验安排，不过TwistDx公司推荐使用探针和TwistAmp® nfo 试剂盒。该技术对硬件设备的要求很低，扩增子达到可检出水平的时间，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。短期可以放在4°C，就应该控制不同引物的量。扩增子应该是可以用于TA克隆的。这种染料可以结合任何双链DNA，这正常么?

是正常的。比如酶标仪或实时检测的热循环仪。此外，

RPA反应的扩增子能保存么?

TwistAmp® Basic或nfo的扩增产物可以保存，温度超过42°C会使酶的活性受到影响。不推荐把插入性染料用于TwistAmp® exo体系，以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，如果不进行产物回收，食品安全、

TwistAmp® exo (RT)的扩增产物不能保存。