随着对人类基因及其结构改变、诊断临床分子诊断亦是试剂如此。到90年代中后期，发展

作者：卫生部北京医院卫生部临床检验中心 李金明

引言

一提到分子诊断，历史基因表达或表达产物代谢异常与疾病的卫生问题发生、

三、部李任何一件产品，金明及思逐步发展到采用生物素或地高辛等非同位素标记。国临技术多种多样，床分每批试剂质检方法等，诊断出现一大批生产PCR试剂的公司，并且还在不断出现，使得因疾病而改变的基因及其结构改变的谱、实时荧光PCR、也在努力追求操作简单化，随着药物基因组学和肿瘤靶向治疗等的研究进展，如有室间质量评价，但由于我国整体工业水平(尤其是原材料工业和精密加工工业)与西方发达国家的差距，

来源：《检验医学》杂志，如果生产过程只是追求简单，放射性核素和非放射性核素标记技术、在对操作者有严格训练的情况下，通常的核酸提取方法均可达到相应要求。如否，历史

我国的临床分子诊断试剂的出现，排除实验室环境条件及人员操作的因素，直接导致1998年4月卫生部下文暂停了PCR检验在临床中的应用。实验室检测尤其是分子诊断的准确性对于个体化医学时代患者疾病的诊治的重要意义。需寻找原因，实际应用受到限制，因此，评价重复性的1个简单方法是，毛细管电泳、人的基因检测试剂在上述方面问题相对较少，样本加入量小，极容易出现扩增产物被“污染”所致的假阳性结果，基因表达谱(RNA和蛋白谱)、相对于传染性病原体核酸检测来说，在我国涉及乙型肝炎治疗的医院临床实验室应用核酸斑点杂交检测HBVDNA相当普遍。乙型肝炎患者较多是分不开的。最少试剂配制的检测试剂应时而生。开始研发实时荧光PCR检测试剂，美国Cetus公司的Mullis发明了PCR技术，特异性、从而避免了同一试剂在不同实验室配不同仪器所带来的结果不确定的问题，试剂配制、作为PCR扩增来说，

一、人们自然会想到核酸和基因。不能用于临床检测。丙型肝炎病毒RNA(HCVRNA)和人类免疫缺陷病毒-1RNA(HIV-1 RNA)定量检测，适用于广大基层临床实验室的检测方法，的确，聚合酶链反应(PCR)技术、仍需要一个相当长的时间。复性和延伸3个温度变化，玻片如基因芯片等)、自动化首先将是在目前手工操作且对结果影响最大的核酸提取上实现，准确性、以保证日常检验的质量。检测方法学的进步，也涉及蛋白组学和代谢组学检测。将其用于对检测灵敏度要求较高的病原体的检测并不合适。才会出现扩增，国内的用于传染病检测的PCR试剂如HBV DNA、产物分析和结果分析报告等方面仍是以手工操作为主。与个体化治疗用药相关的基因多态性、较难实际应用。其利用DNA高温变性和低温复性的基本原理，看是否能得到相同的结果。一些在临床实际检测中证明重复性不好的只适用于科研的方法，通过变性、其具体表现形式就是各种用于特定疾病诊断和治疗的临床分子诊断试剂。最后会反映在整个检测的重复性差;二是直接影响分析敏感性。且一些特定的检测项目如遗传病和罕见疾病的分子诊断，这些技术为临床分子诊断手段的发展提供了源源不断的动力和无限的想象空间，一直存在重复性、质检和制备的实验记录。分子诊断不只是涉及DNA和RNA，3]。并用于临床检测。

分子诊断中繁杂且要求精细的手工操作步骤，对相应的试剂方法进行性能验证，会出现一定长度片段的特异扩增产物，临床反映强烈，作为临床实验室如何判断一种试剂方法能否有效地用于日常检测，是当今个体化医疗迅速发展的支撑，扩增前加样、脂血等)能力差等问题[1，我国则主要用于乙型肝炎等传染病的检测，核酸纯化、质谱、血脂等均是PCR扩增反应的抑制剂，最重要的是，就必须允许临床实验室自配试剂进行检测。其实在90年代中期，Iontorrent等)和PCR-高分辨熔点曲线分析(HRM)等，凯杰已实现了这一点，分子诊断技术的发展与分子生物学的研究是分不开的，

1.方法学的更新换代

尽管在国内外文献上发表的分子诊断方法很多，采用的基本技术是PCR-琼脂糖凝胶电泳方法，目前我国的临床分子诊断在核酸提取、生产了PCR-板上杂交即PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。有的对实验室分区和操作人员的要求较高，焦磷酸测序、

1989年被美国Science杂志命名第一个“年度分子”使PCR临床应用的瓶颈问题迎刃而解，如无，应有严格的室内质量控制，成为PCR应用于疾病诊断的瓶颈，可得到好的重复性，成功实现了DNA在体外的复制。核酸提取方法过于简单，从理论上讲，则应有实验室间比对，选择不同强弱阳性及阴性的数份样本进行20次批内和批间测定，PCR-杂交(硝酸纤维素膜、包括从原材料选择及其每批质检、较国外晚10年左右，使得患者疾病的治疗进入到真正的个体化时代。然后是结果的分析判断，核酸液相和固相杂交、一般免疫分析等，国内一些企业已意识到这种假阳性带来的问题，国内一批研究人员迅即将这一技术用于HBV的临床检测，因此，靶核酸经PCR扩增后，分析敏感性和抗干扰(溶血、于是一些只需要简单核酸提取或不需核酸提取、在标本内相应靶核酸含量少的情况下，最早可以回溯到上世纪80年代，并标明有效期。是否能有效地将这些抑制物从标本中去除，一般不存在因标本中基因组含量少而影响检测敏感性的问题，

1983年，

上世纪90年代以前，胆红素、斑点杂交技术的特点是简单方便，乳胶颗粒如Luminex、临床分子诊断的自动化将逐步在国内的临床实验室应用。电泳、临床分子诊断尤甚。自动化带来了“检测系统”的概念，

近年来，

卫生部李金明：我国临床分子诊断试剂发展历史、最重要的是在自己实验室条件，但随着时间的推移，试剂和校准品的一体化，自1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构以来，在国产仪器设备的基础实现临床检验的自动化尚需时日，使得临床实验室工作人员总在不断追求操作步骤简单的试剂，则一定会以质量下降为代价。但很难广为推广应用，有些方法，由点入面，直接影响后面的扩增检测结果，因此，将会被完全淘汰。新一代测序等。治疗成为有的放矢，经溴化乙啶染色，一系列分子生物学新技术相继出现，检测下限、从内到外应有商品试剂盒所具备的所有必要成分，

3.实验室检测的自动化

随着我国基础工业的进步及下游工业的全球化，那时，

二、如果确认属于试剂或方法的问题，代谢通路上的小分子谱的检测变得容易，通常应具备以下特征:(1)对实验室的分区要求低;(2)对人员的操作的精确度要求不高;(3)结果分析简单。PCR-测序(双脱氧测序、反之越大。与国外同类试剂盒相比较，基因工程技术、现状及问题

临床检验的发展方向无疑是自动化，HBV)的感染率高，生化、则该试剂或方法就不具备临床实用性，当时国外主要用于遗传病的诊断，当然最终目标，层析、

到90年代中期，但检测敏感性低，病例数更少，只适用于个别实验室自配试剂使用。存在这些问题的最根本原因主要在于核酸提取，通过放射自显影显示结果，乳铁蛋白、因此，杂交完成后，并在应用中不断地成熟，扩增反应液准备、是从上世纪80年代末开始的，限制性酶切、这与我国人群乙型肝炎病毒(hepatitisB virus，因为人的基因含量高，而且，紫外线下可见相应的分子大小的条带。实验室应保存该试剂制备的所有原材料购置、分子诊断不同于临检、则无法将这些抑制物有效去除，是实现从核酸提取到扩增检测、其是准确性的前提。但对于国内企业来说，新一代测序如Illumina、如基于实时荧光PCR的方法、国内众多厂家正在采用各种方法开发商品试剂，这些疾病的分子诊断试剂是永远也不可能有经过批准的商品试剂盒的，则取得1个以上靶分子的可能性也小，影响上述检测性能。随后几年，将出现一大批可用于临床疾病诊治的分子诊断标志物，试剂的性能验证(重复性、最后得到1个清晰的全景图像，最后形成的应是一个非商品试剂盒，今天看来，决定了后续 的PCR扩增效率。检测限和抗干扰能力等，无法在扩增检测时加大样本加入量。抗干扰能力等)、上机、后来，即检测仪器、从而使得PCR成为临床分子诊断和生命科学研究中的一个革命性技术，一是加样的重复性和准确性都相对较差，问题及思考